Détecter l'ADN

Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

3 Altmétrique

Détails des métriques

La quantification par une seule molécule de la force et de la spécificité de séquence des interactions entre les protéines et les acides nucléiques faciliterait le sondage de la liaison protéine-ADN. Nous montrons ici que les événements de liaison entre la ribonucléoprotéine Cas9 catalytiquement inactive et toute séquence courte prédéfinie d'ADN double brin peuvent être identifiés en détectant les changements dans le courant ionique alors que des nanostructures d'ADN linéaires à code-barres convenablement conçues avec des surplombs d'ADN double brin se liant à Cas9 se déplacent. à travers des nanopores à l’état solide. Nous avons conçu des nanostructures d'ADN à codes-barres pour étudier les relations entre la séquence d'ADN et la spécificité de liaison à l'ADN, l'efficacité de liaison à l'ADN et la tolérance aux mésappariements d'ADN de Cas9 au niveau d'un seul nucléotide. La détection basée sur les nanopores des nanostructures à codes-barres d'ADN peut contribuer à améliorer la conception de ribonucléoprotéines efficaces et spécifiques pour les applications biomédicales et pourrait être développée dans des tests de détection de protéines sensibles.

La reconnaissance des séquences d'acides nucléiques par les protéines est fondamentale en biologie. En raison de la spécificité de la liaison protéine-ADN, les interactions entre ces biomolécules constituent la base de nombreux outils de biodétection, techniques d’ingénierie biomoléculaire et nouvelles thérapies1,2. En particulier, les systèmes CRISPR/dCas9 à répétitions palindromiques courtes et régulièrement espacées sont apparus comme des outils puissants pour l'expression génique ciblée ainsi que pour le diagnostic, et des travaux substantiels sont actuellement entrepris pour améliorer l'efficacité et la spécificité de CRISPR/Cas3,4. Il est donc essentiel de développer des tests simples et sensibles qui analysent les interactions entre les acides nucléiques et les protéines dans leurs états replié et fonctionnel, afin de capturer leur comportement natif. En outre, il est impératif que ces méthodologies soient sensibles aux différences de séquence entre un seul nucléotide, ce qui peut avoir un impact considérable sur la liaison.

La détection d'impulsions résistives avec des nanopores à l'état solide est une méthode intéressante pour évaluer les événements de liaison. La technique offre la flexibilité nécessaire pour étudier l’ADN, l’ARN et les protéines dans leur état natif avec un seul système de détection. La détection des nanopores repose sur la mesure des modifications du courant ionique lorsque les molécules traversent un pore nanométrique à l'aide d'un champ électrique appliqué. Le changement de courant ionique dû à un événement de translocation reflète la taille, la forme et la charge de la molécule5. Il existe deux types de nanopores : biologiques et solides. Bien que les nanopores de protéines d'origine biologique conviennent parfaitement au séquençage de l'ADN6, les nanopores à l'état solide offrent un contrôle sur la taille des pores pendant le processus de fabrication, permettant ainsi la détection d'une large gamme d'analytes.

Bien que cette polyvalence permette l’analyse d’une variété de biomolécules, le manque de spécificité de la détection présente également un défi pour la détection multiplexée, dans laquelle les cibles d’intérêt doivent être facilement différenciées. Pour surmonter cet obstacle, nous capitalisons sur la nanotechnologie de l'ADN, qui permet la conception et l'assemblage de nanostructures personnalisées contenant des sites de liaison spécifiques pour les protéines d'intérêt7.

Dans cet article, nous fabriquons des nanopores à l’état solide en tirant des capillaires en quartz, également appelés nanopipettes, pour les utiliser comme outil de détection général. L'ADN double brin (ADNdb) crée une chute de courant ionique dans le signal nanopore. Lors de la liaison d’un analyte tel qu’une protéine à l’ADNdb, des pointes de courant secondaires sont créées. En concevant des sites ou des séquences de liaison spécifiques le long d’un brin d’ADN, un motif identifiable est produit. Cette empreinte digitale est observable comme une signature unique de pointes dans le courant ionique. Le marquage et la cartographie de séquences d'ADN natives ciblées dans les nanopores ont déjà été réalisés à l'aide de diverses méthodes, notamment des sondes peptidiques d'acide nucléique8,9, la ligature biochimique10, les facteurs de transcription11 et la modification chimique avec la méthyltransférase et la biotinylation12. Récemment, l'utilisation de l'analyse des nanopores pour mesurer la liaison d'une variante de Cas9 catalytiquement inactif ou mort (dCas9) à l'ADNdb a été démontrée2,13. Notre système s'appuie sur ces travaux de validation de principe initiaux en introduisant des nanostructures d'ADN conçues pour les utilisateurs. des tests de cibles ADN définis, élargissant ainsi l'espace d'application de la détection des nanopores, de la nanotechnologie de l'ADN et du criblage des interactions protéine-ADN. Nous démontrons ici que, lorsqu'ils sont soigneusement conçus et testés, les complexes dCas9 pourraient agir comme un marqueur permettant une cartographie hautement spécifique de l'ADN afin de déterminer les modifications d'une seule paire de bases, ce qui est particulièrement important pour le diagnostic4,14.